本发明公开了一种仿生肝小叶微组织电化学传感器的制备方法及应用，属于传感器检测领域。本发明所述的制备仿生肝小叶结构的3D打印墨水，其组分包括肝癌细胞HepG2、甲基丙烯酰化透明质酸(HAMA)水凝胶溶液、多壁碳纳米管；其中，生物3D打印墨水中肝癌细胞HepG2的终浓度为1×106～1×107cells/mL，HAMA水凝胶的浓度为2％～4％(w/v，g/mL)，多壁碳纳米管的终浓度为0.5～1.4mg/mL。将得到的3D打印墨水用于打印，得到仿生肝小叶微组织模型，再与丝网印刷电极结合，得到仿生肝小叶微组织电化学传感器；实现了对小麦中存在的黄曲霉毒素B1(AFB1)进行定量检测；实现了快检系统构建灵活，毒素检测迅速。