本发明涉及一种混菌发酵制备菜籽肽的方法，充分发挥微生物的水解蛋白质作用和降解硫甙作用，可以有效提高产品的可溶性氮含量和生物活性。所述混菌发酵制备菜籽肽的方法，包括以下步骤：(1)将菜籽粕粉与营养液混合制备液态发酵培养基；(2)将枯草芽孢杆菌、乳酸菌和产朊假丝酵母接入液态发酵培养基，进行液态发酵；(3)发酵后的液态培养基经固液分离，得到菜籽肽的粗提液；(4)粗提液经提纯得到菜籽肽。本发明生产工艺简单、成本低，同时不同微生物混合发酵时产生多种代谢产物和酶类，酶切位点不同，充分发挥微生物的水解蛋白质和降解硫甙作用，有效降解菜籽粕种的有毒物质，水解蛋白质，提高产品的可溶性氮含量、生物活性和菜籽肽得率。