本发明提供了一种金针菇线粒体提取方法，属于微生物技术领域。本发明提供的金针菇线粒体提取方法，包括如下步骤：将样品用巯基化合物溶剂浸泡，离心弃上清，得到浸泡处理的样品；将浸泡处理的样品用山梨醇重悬，得到浸泡处理样品重悬液，在浸泡处理样品重悬液中加入蜗牛酶进行酶解，离心弃上清，得到酶解后的样品；将酶解后的样品使用Mito-Cyto Buffer重悬，离心收集上清；将上个步骤得到的上清离心，收集沉淀，得到线粒体。本发明提供的金针菇线粒体提取方法，操作简单、耗时短，提取的线粒体结构完整、功能活性高。